khimie.ru

Группа кинетических методов анализа (КМА) включает некаталитические и более чувствительные каталитические методы том числе ферментные. Во всех случаях аналитическим сигналом служит скорость какой-либо химической реакции, которую принято называть индикаторной. Теоретическим обоснованием КМА стало учение о кинетике химических реакций, сложившееся в самом конце XIX в. В работах Н. А. Меншуткина и других физико-химиков было установлено, что скорость реакции прямо пропорциональна (при прочих постоянных условиях) текущей концентрации одного из реагентов. Позднее была исследована кинетика гомогенных каталитических реакций; оказалось, их скорость зависит от концентрации веществ-катализаторов, а также активаторов и ингибиторов. В первых работах по КМА за изменением кон­центрации индикаторного вещества — какого-либо из исходных реагентов или одного из продуктов реакции — следили, используя титриметрический или даже визуальный контроль. Например, измеряли время с момента смешивания реагентов до исчезнове­ния или появления окраски исследуемого раствора. Затем скорость индикаторной реакции стали определять, отслеживая с помощью подходящего инструментального метода (фотометрия, флуориметрия, хемилюминесцентный метод, вольтамперометрия, кондуктометрия и др.), как меняется во времени какое-либо свойство раствора, пропорциональное концентрации индикаторного вещества.

При разработке кинетического метода определения главной проблемой является подбор подходящей индикаторной реакции. Она должна отвечать целому ряду довольно жестких требований. В основном в анализе используют каталитические окислительно-восстановительные реакции в водных растворах, биохимические реакции с участием ферментов, а также каталитические реакции на электродах.

Еще в 1876 г. А. Гейерд описал кинетический метод определения соединений ванадия с использованием каталитического эффекта ванадат-ионов при окислении анилина хлоратом калия. В 1934 г. Е. Б. Сендел и И. М. Кольтгоф показали, что иодиды катализируют реакцию окисления мышьяка (ІІІ) церием (IV); на этой основе в 1937 г. они разработали методику определения иодидов. В 1938-1940-е гг. были описаны индикаторные реакции с применением красителей (П. Крумхольц и X. Вацек; Л. Себелледи); по этим реакциям определяли следы золота и марганца (до 10^-11 г/мл). Венгерский аналитик Я. Богнар в 1953 г. исследовал кинетику имеханизм пероксидного окисления о-дифенолов (катализатор-ионы Со²⁺). На этой основе были разработаны чувствительные методики определения следов (вплоть до 10^-12  г/мл) кобальта.

В 1935 г. Я. Гейровский впервые применил для определения катализаторов совершенно иной тип индикаторных реакций, Они протекали на электродах и приводили появлению так называемых каталитических полярографических токов, пропорциональных скорости реакции. По силе каталитического тока Я. Гейровский определял очень малые концентрации рения. Позднее таким способом определяли содержание платиновых металлов, молибдена, некоторых органических веществ. В разработку теории каталитических токов большой вклад внес А. Н. Фрумкин.

С 1952 г. индикаторные реакции разного типа систематически исследовали известный советский химик К. Б. Яцимирский с сотрудниками. К. Б. Яцимирским были разработаны кинетические методы определения многих металлов с применением каталитических окислительно-восстановительных реакций в водных растворах, а также некоторых других реакций. В 1963 г. К. Б. Яцимирский издал первую монографию, посвященную КМА, где было дано глубокое обобщение ранее накопленного материала, развита теория метода (способы регистрации и обработки кинетических кривых, типы и механизмы индикаторных реакций), проанализированы возможные источники погрешностей, намечены пути повышения чувствительности и селективности КМА. Издание этой книги, а затем и зарубежные переводы стимулировали интерес к кинетическим методам. В 1970—1980-е гг. советские аналитики (Л. П. Тихонова, И. Ф. Долманова, И. И. Алексеева, С. У. Крейнгольд, Р. П. Панталер и др.) создали множество новых методик для определения металлов, а также предложили кинетические методы определения неметаллов и органических веществ. Последние чаше определяют по их ингибирующему или активирующему действию на ион металла-катализатора.

Первая оригинальная книга по КМА на английском языке (X. Марк и Г. Речниц) появилась в 1968 г. (русское издание 1972 г.). Заслугой этих авторов стало привлечение внимания аналитиков к некаталитическим реакциям. Последние не позволяют разрабатывать высокочувствительные методики, но зато дают возможность Раздельно определять те структурно-родственные вещества, равновесные свойства которых близки, а кинетические заметно разсличаются. Так, еще в 1930 г. в США был предложен остроумный способ раздельного определения изомеров бутена, основанный на разной скорости взаимодействия продуктов их бромирования йодидом калия.

В 1940— 1950-е гг. были разработаны кинетические способы анализа смесей, компоненты которых однотипно реагируют с одним и тем же реагентом с сильно различающимися скоростями. Примером может быть взаимодействие смеси углеводов с антроном (С. Бонтинг, 1954). В дальнейшем И. М. Кольтгоф и Дж. Ли преддожили расчетный алгоритм для более сложного случая, когдакомпоненты смеси имеют близкие значения констант скорости Математический аппарат для решения подобных задач подробно рассмотрен в книге X. Марка и Г. Речница.

К 1970-м гг. для аналитиков стало очевидно, что кинетические методы просты, не требуют сложного оборудования, как правило — очень чувствительны и селективны, но, к сожалению, подчас капризны и недостаточно точны. Кинетические методы использовали в анализе химических реактивов, функциональных материалов и лекарственных препаратов, в гидрохимическом анализе, при определении микроэлементов в почвах и биообъектах.

Самым перспективным оказалось направление КМА, связанное с биологическими катализаторами (ферментами), — ферментативный анализ. Кинетические методы применимы для определения самих ферментов, их субстратов (т.е. соединений, превращения которых катализируют ферменты), а также соединений, воздействующих на каталитическую активность ферментов, так называемых эффекторов — активаторов и ингибиторов. Естествен­но, для соответствующих методик требуются высокоактивные ферменты, выделенные из подходящих источников (растительное сырье, ткани животных, микроорганизмы). Обычно это белки.

Ферменты обладают уникальными свойствами, выделяющими их на фоне обычных катализаторов. Прежде всего, это необычайно высокая активность. Добавка фермента, даже в концентрации порядка 10^-9 моль/л, может ускорить превращение субстрата в 10⁸ — 10¹² раз. Другое важное свойство ферментов — избирательность их действия в отношении структуры субстрата. Так, фермент уреаза катализирует только гидролиз мочевины. В то же время эффективно влияет на скорость этой реакции только уреаза. Специфичность взаимодействия в паре фермент — субстрат, неоднократно сопоставляемая со специфичностью пары «ключ-замок», обусловлена сложной структурой и весьма сложным механизмом действия фермента.

Исследование реакций с участием ферментов началось еще в XIX в. (К.Кирхгоф, Й. Я. Берцелиус). Специфичность ферментной активности установлена Э. Фишером в конце XIX в. Важную рольсыграли работы Л. Михаэлиса по кинетике и механизму ферментных реакций (1913). Аналитическое применение этих реакций началось в 1950-е гг., вначале в биохимических и медицинских исследованиях, позднее и в других областях.

Определению концентрации самих ферментов было посвящено относительно немного работ, причем они имели свою специфику. Если определяемый фермент был недоступен в чистом виде (а поначалу промышленность химических реактивов ферменты не выпускала), то нельзя было приготовить стандартные растворы с известной концентрацией фермента, нельзя было построить градуировочный график, характеризующий зависимость скорости реакции от концентрации фермента, нельзя использовать привычные для аналитиков способы расчета результата анализа. Авторы первых методик определения ферментов обычно ограничивались результатом, выраженным в условных единицах, они оценивали лишь «активность» фермента в тех или иных объектах, а не его концентрацию. Это не мешало использованию методик в клиническом анализе. Результаты анализов, выраженные в условных единицах, пригодны для диагностики.

Первым ферментом, выделенным в кристаллическом виде, была уреаза, кристаллы которой получил Дж. Самнер еще в 1926 г. Несколько позже Дж.Х. Нортроп сумел выделить в чистом виде пепсин и множество протеолитических ферментов. К началу XXI в. коммерчески доступными стали около 2 тыс. чистых ферментных препаратов, в том числе важнейшие регуляторы биохимических процессов в организме человека. Теперь появилась возможность точного и экспрессного определения этих ферментов в крови и других объектах клинического анализа. Причем не в условных единицах, а в единицах концентрации.

Для определения субстратов или эффекторов знать точную концентрацию фермента не обязательно, достаточно во все пробы и эталоны вводить одно и то же количество ферментсодержащего раствора. Поэтому количественно определять субстраты проще, и такие работы появились раньше. Пример — работы по определению глюкозы с применением разных ферментов. Другой пример — ферментативное определение уровня холестерина в крови. Этот показатель важен для диагностики и контроля эффективности лечения ряда заболеваний, например атеросклероза.

Еще больше работ посвящено методам определения эффекторов — как неорганических (ионы тяжелых металлов, прежде всего ионы ртути; разные анионы, например фториды), так и органических. Классический пример определения органических эффекторов — разработанные еще в 1960-х гг. методики определения Фосфорорганических соединений (гербицидов, инсектицидов), ингибирующих фермент холинэстеразу (Т. Ньютон и др.). Методы определения эффекторов оказались менее селективными, но более чувствительными, чем методы определения субстратов. Если пределы обнаружения субстратов обычно находятся в диапазоне 10^-6 − 10^-4 моль/л, то пределы обнаружения органических эффекторов — 10^-11 – 10^-8 моль/л. Устанавливая активность холинэстеразы, можно достоверно определить всего 0,015 мкг инсектицида, ингибитора. Отметим также, что число эффекторов ферментов значительно больше, чем число их субстратов, и это расширяет возможности ферментативных методов. Поэтому значительная часть исследований посвящается именно определению эффекторов. В этой области серьезные успехи связаны с работами группы исследователей кафедры аналитической химии химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Не все методики, связанные с применением ферментов, следует относить к кинетическим методам анализа. Нередко создают условия, в которых определяемое вещество полностью реагирует с ферментом и избытком субстрата, а затем измеряют оптическую плотность продукта реакции. В этом случае мы имеем дело с особым вариантом фотометрического анализа. Пример — предложенная в 1970-е гг. методика фотометрического определения микрограммовых количеств этанола с помощью фермента алкоголь-дегидрогеназы и распространенного в биохимии реагента никотинамидадениндинуклеотида (НАД). Продукт восстановления НАД этанолом фотометрируют в УФ области. Этанол можно определить и в кинетическом, и в стехиометрическом варианте, каждый из вариантов имеет свои достоинства.

При определении субстратов и эффекторов используют примерно 50 разных ферментов. Они должны сохранять каталитическую активность в течение длительного времени. Однако при хранении и в ходе выполнения повторных анализов фермент может частично или полностью терять свою каталитическую активность (инактивироваться). Проблема стабильности ферментных препаратов встала перед аналитиками в 1980-е гг., когда соответствующие методики стали широко использовать в лабораториях клинического анализа.

Самым эффективным способом стабилизации ферментов ока­залась иммобилизация — перевод в водонерастворимое состояние путем связывания с носителем или модифицирование растворимыми в воде полимерами. После иммобилизации ферменты полностью или частично сохраняют свою каталитическую активность. В 1965 г. для обнаружения фосфорорганических пестицидов в воздухе была использована холинэстереза, включенная в крахмальный гель, нанесенный на полиуретановую пластину. По-видимому, это было первое применение иммобилизованных ферментов в анализе. В 1990-е гг. такой подход стал весьма популярным. Повышение стабильности и возможность многократного использования иммобилизованных ферментов значительно снижают стоимость анализов, позволяют проводить их вне лабораторий (тест-методы, ферментные электроды). Метод быстро развивается. Как показывают некоторые зарубежные авторы, число биохимических анализов, выполняемых с применением ферментов в медицинах учреждениях, уже значительно превышает число всех анализов выполняемых на промышленных предприятиях каким бы то ни было методом.

В самом конце XX в. возник еще один метод анализа, в котором используют реакции с участием ферментов, — иммуноферментный метод (к числу кинетических методов его не относят). Высокая чувствительность здесь удачно сочетается с уникальной специфичностью иммунохимического взаимодействия определяемых веществ (антигенов) с вырабатываемыми организмом антителами. Создание экспрессных и высокочувствительных иммуноферментных методов определения белков, гормонов, стероидов и других веществ было очень важно для клинического анализа, для микробиологической, фармакологической и пищевой промышленности, для ветеринарии и сельского хозяйства, а также для контроля загрязнения окружающей среды.